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Fluoreszensspektrometer Perkin-Elmer LS55

Fluoreszenzspektrometer

Fluoreszenzspektrometer Perkin-Elmer LS55

 

Die Fluoreszenzspektroskopie macht sich die Eigenschaft zunutze, dass viele Moleküle bei Lichtbestrahlung eine ganz spezifische frequenzabhängige Lichtemission zeigen. Hierbei handelt es sich hauptsächlich um Fluoreszenz und Phosphoreszenz. Dies wird allgemein als Photolumineszenz bezeichnet.

Durch Bestrahlung wird ein Molekül in einen der höheren elektronischen Zustände angeregt. Von diesem relaxiert es schnell (10-14 s) und strahlungslos zum ersten elektronisch angeregten S1-Zustand. Von diesem aus wird schließlich nach Ablauf einer Zeitspanne von etwa 10-9 s durch Emission der elektronische Grundzustand S0 erreicht.

Während dieser Zeitspanne beeinflusst die Umgebung das angeregte Molekül und somit das Emissionsspektrum.

So ermöglicht die Fluoreszenzspektroskopie durch Ermittlung verschiedener Parameter (z. B. der Quantenausbeute  der Polarisation p oder der Anisotropie r) Rückschlüsse auf die das Fluorophor umschließende Umgebung.

Durch Auswahl eines geeigneten fluoreszierenden Sondenmoleküls ist es möglich, gezielt Informationen über biologische Systeme zu erhalten.

Unter Verwendung von Pyren als Sonde können Informationen zur Polarität seiner Umgebung erhalten werden.

TO-Pyren

 

Dieses ist möglich, da das Emissionsspektrum von Pyren eine von der Polarität abhängige Form zeigt, und die Intensität von Peak III mit dieser variiert.

TO-Pyren_Wasser

Emissionsspektren von in wässriger und in mizellarer Lösung gelösten Pyren

 

 

Emissionsspektren von in wässriger und in mizellarer Lösung gelösten Pyren.

Bei Zugabe eines Tensids (Sodiumdodecylsulfat) zu einer wässrigen Lösung steigt die Intensität des Peaks III aufgrund der Bildung von Mizellen, da das Pyren-Molekül nun im unpolaren Mizellkern solubilisiert ist.

TO-Mizellen_Fluoreszenz klein

 

Durch Bildung des Quotienten der Intensitäten von Peak I und III erhält man einen von der Pyrenkonzentration unabhängigen Wert, der es ermöglicht, Polaritäten der ´Pyren-Umgebung´ abzuschätzen.

TO-Polaritaetsverlauf

 

Die obige Abbildung zeigt den Polaritätsverlauf wässriger Tensid-Lösungen.

Der Verlauf der Polarität erreicht bei höheren Tensidkonzentrationen ein Plateau. Das Erreichen dieses Plateaus signalisiert die vollständige Ausbildung von Mizellen.

Wird 1,3-bis-(1-pyrenyl)propan als Fluoreszenzprobe verwendet, sind durch Auswertung des Emissionsspektrums Informationen über die Microfluidität (auch als Mikroviskosität bezeichnet) der Probenumgebung zugänglich.

Die Mikroviskosität der Probenumgebung (z. B. die Membran einer Zelle) beeinflusst die Drehbarkeit der über eine Propyl-Brücke verbundenen Pyren-Teile. Das Molekül weist zwei Grenzkonformationen auf, welche sich deutlich in ihrem Emissionsspektrum unterscheiden.

TO-Grenzkonformationen

 

Antiparallele Stellung                                             Parallele (Excimer) Stellung

Im Spektrum steigt mit zunehmenden Anteil von Molekülen mit paralleler Stellung die Emissionsbande zwischen 450 und 600 nm.

Durch Salzzugabe zu einer ionischen Tensidlösung wird eine Veränderung der Mizellgestalt induziert. Dabei steigt die Anzahl der Tensidmoleküle einer Mizelle und die Mizelle wächst. Mit diesem Wachsen geht eine Formveränderung von sphärisch- zu stäbchenförmigen Mizellen einher.

Innerhalb stäbchenförmiger Mizellen sind Tensidmonomere ´enger´ gepackt, und die Mikroviskosität ist höher.

Dies wird durch den mit der Salzkonzentration zunehmenden Anstieg der Fluoreszenzbande bei 500 nm angezeigt.

TO-Salzzugabe

 

 Die Kombination fluoreszierender Moleküle mit fluoreszenzlöschenden Molekülen ermöglicht die Bestimmung der Aggregationszahlen von Mizellen mittels statistischer Verfahren.

Hierzu wird bei konstanten Fluorophor- und Tensidkonzentration die mit steigender Quencherkonzentration (z. B. Trimethyl-Cetylpyridinium Chlorid) verbundene Abnahme der Fluoreszenzintensität verfolgt.

 

Der mathematische Zusammenhang,

TO-Formel01

 

der einen linearen Bezug zwischen Fluoreszenzintensitäten und Quencherkonzentrationen herstellt, ermöglicht es, Nagg. aus der Steigung zu berechnen.

TO-Aggregationszahl